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細(xì)胞培養(yǎng)生物污染

細(xì)胞培養(yǎng)物污染往往是細(xì)胞培養(yǎng)實驗室中最常見的問題，有時會造成非常嚴(yán)重的后果。細(xì)胞培養(yǎng)污染物可分為兩大類，一類是化學(xué)污染物，如培養(yǎng)基、血清和水中 的雜質(zhì)，包括內(nèi)毒素、增塑劑和洗滌劑，另一類是生物污染物，如細(xì)菌、霉菌、酵 母、病毒和支原體，以及其他細(xì)胞系的交叉污染。雖然污染無法完全消除，但可以通過全面了解其來源并遵循良好的無菌技術(shù)來降低污染的發(fā)生頻率和嚴(yán)重性。以下將概述主要的生物污染類型。

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細(xì)菌

細(xì)菌是一大類普遍存在的單細(xì)胞微生物。細(xì)菌的直徑通常只有幾微米，其形狀多樣，如球狀、桿狀和螺旋狀等。由于分布廣泛、生長迅速和體積大小等特點，細(xì)菌以及酵母和霉菌是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物。

細(xì)菌污染在培養(yǎng)物感染后幾天內(nèi)就很容易被肉眼觀察到；受感染的培養(yǎng)物通常會變得渾濁，有時表面會有一層薄膜。經(jīng)常還會出現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然下降的情況。在低倍顯微鏡下，細(xì)菌以細(xì)小顆粒的形式出現(xiàn)在細(xì)胞之間，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出單個細(xì)菌的形狀。

酵母

酵母是真菌界中的單細(xì)胞真核微生物，大小從幾微米（常見）到40μm（罕見）不等。與細(xì)菌污染一樣，被酵母污染的培養(yǎng)物會變得混濁，尤其是在污染的后期。被酵母污染的培養(yǎng)物，其pH值幾乎沒有變化，通常直到污染嚴(yán)重時，pH值才會升高。在顯微鏡下，酵母呈單個卵球形或球形顆粒，可能還會出芽產(chǎn)生更小的顆粒。下面的模擬圖像顯示了貼壁293細(xì)胞鋪板24小時后被酵母感染的情況。

霉菌

霉菌是真菌界的真核微生物，以多細(xì)胞絲狀體生長，稱為菌絲。這些多細(xì)胞絲狀體構(gòu)成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)含有遺傳性相同的細(xì)胞核，被稱為集落或菌絲體。與酵母污染相似，培養(yǎng)物的pH值在污染的初期保持穩(wěn)定，然后隨著培養(yǎng)物感染程度加劇而迅速增加，并變得渾濁。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)長的絲狀體，有時呈密集的孢子團(tuán)。許多種霉菌的孢子在休眠階段能夠耐受極其惡劣和不宜生長的環(huán)境，當(dāng)其遇到合適的生長條件時才會被激活。

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病毒

病毒是一種微小的感染性病原體，利用宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行繁殖。它們的體積極小， 難以在培養(yǎng)中被檢測到，也難以從細(xì)胞培養(yǎng)實驗室使用的試劑中去除。由于大多數(shù) 病毒對宿主有非常嚴(yán)格的要求，因此，它們通常不會對宿主以外物種的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生不良影響。但被病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物會對實驗室人員造成嚴(yán)重的健康威脅， 尤其是當(dāng)實驗室培養(yǎng)的是人類或靈長類的細(xì)胞時。要檢測細(xì)胞培養(yǎng)物是否被病毒感 染，可以使用電子顯微鏡觀察、用抗體組合進(jìn)行免疫染色、ELISA檢測或是使用合適 的病毒引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

支原體

支原體是無細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是最小的自我復(fù)制生物。由于支原體非常小（ 通常小于1 μm），因此很難被檢測到，除非它們達(dá)到了極高的密度，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物變質(zhì)；在此之前，通常沒有明顯的感染跡象。一些生長緩慢的支原體可在培養(yǎng)物中持續(xù)存活，而不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但它們可以改變培養(yǎng)體系中宿主細(xì)胞的行為和代謝。

慢性支原體感染的可能表現(xiàn)包括：細(xì)胞增殖率降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；但是，檢測支原體污染可以通過使用熒光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測定法定期檢測培養(yǎng)物。

交叉污染

雖然不如微生物污染普遍，但許多細(xì)胞系與HeLa以及其他快速生長細(xì)胞系之間的廣泛交叉污染已經(jīng)是一個明確的問題，會產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。從值得信賴的細(xì)胞庫中獲取細(xì)胞系，定期檢查細(xì)胞系的特性，并使用良好的無菌技術(shù)進(jìn)行操作，這些做法都將幫助您避免交叉污染。DNA指紋圖譜分析、核型分析和細(xì)胞亞型分析可以確定細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在交叉污染。

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使用抗生素

請勿在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗生素，因為抗生素的連續(xù)使用會促進(jìn)耐藥菌株的生長，并導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，就會發(fā)展成大規(guī)模污染。抗生素的持續(xù)使用還可能掩蓋支原體感染和其他隱性污染。此外，某些抗生素可能會與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾正在研究的細(xì)胞過程。

抗生素只能作為對付污染的最后手段且只能短期使用，并應(yīng)盡快從培養(yǎng)物中去除。如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時進(jìn)行無抗生素培養(yǎng)，作為檢測隱性感染的對照。